色谱柱-淋洗液罐-巴罗克试剂槽-巴氏吸管-5ml样品瓶-SBS液氮冻存管-上海希言科学仪器有限公司

產品展示
PRODUCT DISPLAY
技術支持您現在的位置:首頁 > 技術支持 > 細胞凍存和復蘇實驗
細胞凍存和復蘇實驗
  • 發布日期:2017-12-19      瀏覽次數:1995
    • 細胞凍存和復蘇:(1)用于生物學保種;(2)用于醫學上干細胞研究;(3)用于傳代培養。

      實驗方法原理

      細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外,減少細胞內冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法,這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

       

      實驗材料

      細胞

      試劑、試劑盒

      D-Hanks液小牛血清培養液青霉素鏈霉素胰蛋白酶HClNaHCO3DMSO甘油

      儀器、耗材

      微量加樣槍吸頭離心管凍存管槍頭膠塞移液管玻璃瓶紅血球計數板記號筆醫用橡皮膏移液槍超凈工作臺離心機恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養箱液氮冰箱

      實驗步驟一、材料準備
       

      1.  儀器:凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差顯微鏡、培養箱、液氮冰箱。

       

      2.  玻璃器皿:吸管(彎頭、直頭)、 培養瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、廢液缸。

       

      3.  塑料器皿: 吸頭、槍頭、膠塞、移液管(10ml)、15ml離心管、凍存管(1~2ml)。

       

      4.  其他物品:微量加樣槍、紅血球計數板、記號筆、醫用橡皮膏、移液槍。

       

      5.  試劑:D-Hanks液、小牛血清、培養液、雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶(0.08%)、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO(分析純)或無色新鮮甘油。

      二、細胞凍存

       

      1.  配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養液。

       

      2.  取對數生長期的細胞,用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來,懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。

       

      3.  離心1 000 rpm,5 min。

       

      4.  去除胰蛋白酶及舊的培養液,加入適量配制好的凍存培養液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數,調節凍存液中細胞的zui終密度為5×106/ml~1×107/ml。

       

      5.  將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml。

       

      6.  在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者。

       

      7.  凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內。

       

      三、 細胞復蘇

       

      1.  從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。

       

      2.  從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養液,混勻。

       

      3.  離心, 1 000 rpm,5 min。

       

      4.  棄去上清液,加入含10%小牛血清培養液重懸細胞,計數,調整細胞密度,接種培養瓶,37℃培養箱靜置培養。

       

      5.  次日更換一次培養液,繼續培養。

      收起 
      注意事項

      1.  從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存,但為對數生長期細胞。在凍存前一天換一次培養液。

       

      2.  將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷。
       

      3.  凍存和復蘇用新配制的培養液。

      其他

      一、凍存和復蘇的原則:慢凍快融

       

      當細胞冷到零度以下,可以產生以下變化:細胞器脫水,細胞中可溶性物質濃度升高,并在細胞內形成冰晶。

       

      如果緩慢冷凍,可使細胞逐步脫水,細胞內不致產生大的冰晶;相反,結晶就大,大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重結晶。

       

      二、慢凍程序

       

      1.  標準程序:采用細胞凍存器

       

      當溫度在-25 ℃以上時,  1~2 ℃/min;

       

      當溫度達-25 ℃以下時, 5~10 ℃/min;

       

      當溫度達-100℃時,可迅速放入液氮中。

       

      2.  簡易程序:將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內,紗布袋系以線繩,通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,在40 min內降至液氮表面過夜,次晨投人液氮中。

       

      3.  傳統程序:冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽長期儲存。

       

      三、低溫保護劑的應用

       

      在細胞凍存時加入溫保護劑,能大大提高凍存效果。

       

      常用的低溫保護劑是DMSO,它是一種滲透性保護劑,可迅速透入細胞,提高胞膜對水的通透性,降低冰點,延緩凍結過程,能使細胞內水分在凍結前透出細胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內冰晶,從而減少冰晶對細胞的損傷。

       

      四、細胞凍存方法

       

      1.  預先配制凍存液

       

      (1)10%DMSO + 細胞生長液(20%血清+基礎培養液)

       

      (2)10%甘油+ 細胞生長液(20%血清+基礎培養液)

       

      2.  取對數生長期細胞,經胰酶消化后,加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細胞/ml)。

       

      3.  加入1 ml細胞于凍存管中,密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。

       

      五、保存細胞的復蘇方法

       

      1.  快速解凍

       

      凍存細胞從液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,輕輕搖動冷凍管,使其在1 分鐘內全部融化(不要超過3 分鐘)。

       

      2.  解凍后的細胞可直接接種到含*生長培養液的細胞培養瓶中直接進行培養,24小時后再用新鮮*培養液替換舊培養液,以去除DMSO。

       

      3.  如果細胞對冷凍保護劑特別敏感

       

      解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑,然后再接種到含*生長培養液的培養瓶中。

    魏經理
    • 手機

      13224517959

    主站蜘蛛池模板: 必胜高考网_全国高考备考和志愿填报信息平台 | YT保温材料_YT无机保温砂浆_外墙保温材料_南阳银通节能建材高新技术开发有限公司 | 东莞市踏板石餐饮管理有限公司_正宗桂林米粉_正宗桂林米粉加盟_桂林米粉加盟费-东莞市棒子桂林米粉 | 浙江富广阀门有限公司 | led太阳能路灯厂家价格_风光互补庭院灯_农村市政工程路灯-中山华可路灯品牌 | 刘秘书_你身边专业的工作范文写作小秘书 | 磁力抛光机_磁力研磨机_磁力去毛刺机-冠古设备厂家|维修|租赁【官网】 | 不锈钢轴流风机,不锈钢电机-许昌光维防爆电机有限公司(原许昌光维特种电机技术有限公司) | 国产离子色谱仪,红外分光测油仪,自动烟尘烟气测试仪-青岛埃仑通用科技有限公司 | 翅片管散热器价格_钢制暖气片报价_钢制板式散热器厂家「河北冀春暖气片有限公司」 | 家乐事净水器官网-净水器厂家「官方」 | 长沙网站建设制作「网站优化推广」-网页设计公司-速马科技官网 | 杭州成人高考_浙江省成人高考网上报名 | 消泡剂_水处理消泡剂_切削液消泡剂_涂料消泡剂_有机硅消泡剂_广州中万新材料生产厂家 | 紧急泄压人孔_防爆阻火器_阻火呼吸阀[河北宏泽石化] | 校园气象站_超声波气象站_农业气象站_雨量监测站_风途科技 | 化工ERP软件_化工新材料ERP系统_化工新材料MES软件_MES系统-广东顺景软件科技有限公司 | 国资灵活用工平台_全国灵活用工平台前十名-灵活用工结算小帮手 | 电线电缆厂家|沈阳电缆厂|电线厂|沈阳英联塑力线缆有限公司 | 除湿机|工业除湿机|抽湿器|大型地下室车间仓库吊顶防爆除湿机|抽湿烘干房|新风除湿机|调温/降温除湿机|恒温恒湿机|加湿机-杭州川田电器有限公司 | PTFE接头|聚四氟乙烯螺丝|阀门|薄膜|消解罐|聚四氟乙烯球-嘉兴市方圆氟塑制品有限公司 | 电磁流量计_智能防腐防爆管道式计量表-金湖凯铭仪表有限公司 | 申江储气罐厂家,储气罐批发价格,储气罐规格-上海申江压力容器有限公司(厂) | 走心机厂家,数控走心机-台州博城智能科技有限公司 | 在线悬浮物浓度计-多参数水质在线检测仪-上海沃懋仪表科技有限公司 | 袋式过滤器,自清洗过滤器,保安过滤器,篮式过滤器,气体过滤器,全自动过滤器,反冲洗过滤器,管道过滤器,无锡驰业环保科技有限公司 | 广州迈驰新GMP兽药包装机首页_药品包装机_中药散剂包装机 | 成人纸尿裤,成人尿不湿,成人护理垫-山东康舜日用品有限公司 | 电渗析,废酸回收,双极膜-山东天维膜技术有限公司 | SRRC认证|CCC认证|CTA申请_IMEI|MAC地址注册-英利检测 | 贝朗斯动力商城(BRCPOWER.COM) - 买叉车蓄电池上贝朗斯商城,价格更超值,品质有保障! | Boden齿轮油泵-ketai齿轮泵-yuken油研-无锡新立液压有限公司 | 废气处理设备-工业除尘器-RTO-RCO-蓄热式焚烧炉厂家-江苏天达环保设备有限公司 | 南京展台搭建-南京展会设计-南京展览设计公司-南京展厅展示设计-南京汇雅展览工程有限公司 | 工作服定制,工作服定做,工作服厂家-卡珀职业服装(苏州)有限公司 | 润滑脂-高温润滑脂-轴承润滑脂-食品级润滑油-索科润滑油脂厂家 | 山东聚盛新型材料有限公司-纳米防腐隔热彩铝板和纳米防腐隔热板以及钛锡板、PVDF氟膜板供应商 | 集菌仪厂家_全封闭_封闭式_智能智能集菌仪厂家-上海郓曹 | 点胶机_点胶阀_自动点胶机_智能点胶机_喷胶机_点胶机厂家【欧力克斯】 | 二氧化碳/活性炭投加系统,次氯酸钠发生器,紫外线消毒设备|广州新奥 | 聚氨酯复合板保温板厂家_廊坊华宇创新科技有限公司 |